Primer Congreso Virtual Iberoamericano de Neurología  Barra de Navegación

COMUNICACION NUMERO 29

 

TITULO

ANÁLISIS DE MICROSATÉLITES EN MENINGIOMAS Y NEURINOMAS

 

AUTORES

MJ Sobrido, C Rodriguez-Pereira, F Barros, A Carracedo, J Forteza, M Lema

Servicio de Neurología (MJS, ML), Unidad de Medicina Molecular (AC, FB, MJS) y Servicio de Anatomía Patológica (CRP*, JF). Complejo Hospitalario Universitario de Santiago. Santiago de Compostela. España.
* Actualmente en el Servicio de Anatomía Patológica, Hospital General de Castellón, España.

Dirección de correo electrónico: msobrinog@meditex.es

 

TITULO |  AUTORES |  RESUMEN |  INTRODUCCION
MATERIAL Y METODOS | RESULTADOS | ICONOGRAFIA |  DISCUSION Y CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFIA |  ENVIAR COMENTARIOS |  VOLVER AL INDICE

 

 

RESUMEN

El análisis comparativo de marcadores microsatélites (STRs) en ADN de células neoplásicas y en el ADN constitucional correspondiente permite identificar dos tipos de fenómenos relacionados con la oncogénesis: 1) inestabilidad de microsatélites (variaciones en el tamaño de alguno de los alelos o aparición de alelos adicionales) y 2) pérdidas de heterocigosidad (desaparición de un alelo), que señalan regiones genómicas potencialmente implicadas en el desarrollo neoplásico. Hemos examinado el ADN de 25 meningiomas y 10 neurinomas y el ADN obtenido de leucocitos de sangre periférica de los mismos pacientes. Siete STRs distribuidos en 6 cromosomas fueron amplificados por PCR y detectados mediante un secuenciador automático. Un meningioma (4%) mostró inestabilidad en dos loci STR. Se encontró pérdida de heterocigosidad (PDH) de 21q en el 15% de los meningiomas. El 16,6% tenían PDH en 1q. Casos aislados presentaron PDH en 4q (5%), 9q (4,8%) y 19p (4,3%). Ningún neurinoma presentó alteraciones en los loci analizados.

 

INTRODUCCION

Los microsatélites (STRs) son secuencias repetitivas simples de ADN constituidas por unidades de repetición de 2 a 7 pares de bases (pb) y de aproximadamente 100-400 pb de longitud total, distribuidas por el genoma de las células eucariotas.(1) Su abundancia y su naturaleza polimórfica los convierte en marcadores útiles para diversos tipos de análisis. Cada microsatélite específico puede ser amplificado por PCR y visualizado por distintas técnicas.

En los últimos años se ha caracterizado una nueva vía de carcinogénesis consistente en el fallo de los sistemas de control de la fidelidad de replicación del ADN (2), lo cual da lugar a una inestabilidad genómica intrínseca que favorece el acúmulo de mutaciones y el desarrollo tumoral.(3) En esta situación, los STRs presentan frecuentes mutaciones somáticas en el tumor, manifestadas por alteraciones en la longitud de los alelos o la aparición de alelos extra en el ADN tumoral cuando se compara con el ADN constitucional correspondiente. A este fenómeno se le ha denominado inestabilidad de microsatélites (IM) o fenotipo de error de replicación (RER+) y fue descrito inicialmente en el cáncer de colon hereditario.(4-6) Con posterioridad se descubrió que este fenotipo mutador a su vez es debido a mutaciones en los genes reparadores de mismatch.(7,8) En pocos años se acumularon evidencias de IM en diversas neoplasias esporádicas como cáncer gástrico (9) pancreático (9) cáncer de vejiga (10) pulmón (11) endometrio (12) y otras, incluidos diversos tumores cerebrales.(13,14) La importancia de este tipo de inestabilidad genética en meningiomas y neurinomas no está bien definida. La frecuencia de IM descrita en meningiomas en trabajos previos es muy variable, oscilando entre 0 y 25%.(14-16) Sólo hemos podido encontrar un estudio de IM en el que se incluyen neurinomas, sin referir ningún caso de inestabilidad. (14)

Los microsatélites también son marcadores útiles para el análisis de pérdidas de heterocigosidad (PDH) en tumores.(17,18) La PDH se identifica por la desaparición de un alelo en el tumor al comparar loci STRs en ADN normal y tumoral del paciente. Estas deleciones permiten localizar regiones cromosómicas candidatas para contener genes implicados en la oncogénesis, particularmente genes supresores tumorales.(19) Meningiomas y neurinomas muestran frecuentes pérdidas alélicas en el cromosoma 22. En meningiomas se han asociado, además, loci de los cromosomas 1, 10 y 14 con un fenotipo más agresivo (20,21), mientras que en neurinomas no se han implicado genes en otras localizaciones diferentes del cromosoma 22.(22)

Con el objeto de contribuir al conocimiento molecular de estas dos frecuentes neoplasias del sistema nervioso hemos abordado el estudio de STRs utilizando, por primera vez, un secuenciador automático fluorescente para el análisis de microsatélites en estos tumores.

 

MATERIAL Y METODOS

Recogida de muestras

Tumores: Del archivo de Anatomía Patológica del Complejo Hospitalario de Santiago se obtuvieron las muestras de tejido tumoral fijadas con formol tamponado al 10% e incluidas en parafina. De cada tumor se realizaron cortes de 4 micras para su procesado y tinción por métodos de rutina. El diagnóstico histológico de los tumores se realizó según la clasificación de la OMS.(23) De aquellos bloques en los que más del 80% de la muestra correspondía a tumor se obtuvieron cortes de 10 micras que se depositaron en un tubo de centrífuga para la extracción del ADN. Cuando menos del 80% de la muestra era tejido tumoral los cortes se tiñeron con azul de toluidina y se emplearon para seleccionar una zona adecuada de tumor mediante microdisección con un bisturí.

Sangre: Como fuente de ADN constitucional se obtuvieron 4 ml de sangre periférica de cada paciente, previo consentimiento informado.

Extracción de ADN

ADN tumoral: Las muestras se lavaron con xileno durante un mínimo de 2 horas para disolver la parafina. Se centrifugaron durante 15 minutos a máxima velocidad y se eliminó el sobrenadante. Se sometió el pellet a tres lavados con etanol a concentraciones decrecientes y se dejó evaporar por completo el resto de etanol tras el último lavado. Se resuspendieron en 50-100 µ l de un tampón de digestión constituido por Tris-ClH 50mM ph 8.5, EDTA 1 mM, Tween 20 0.5% y 200 µ g/ml de proteinasa K. Se incubaron durante 2 horas a 56ºC y finalmente se inactivó la proteinasa K a 95ºC durante 10 minutos.

ADN constitucional: El ADN de leucocitos de sangre periférica se extrajo por el método convencional de fenol-cloroformo.

Análisis de microsatélites

Se amplificaron dos loci dinucleotídicos (D9S153, D9S1867) y cinco loci tetranucleotídicos (D19S394, D21S11, FIBRA/FGA, D12S391, D1S1656). La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen final de 25 µ l, conteniendo 5-20 ng de ADN problema, 10 mM de ClH, 50 mM de KCl, 1,5 mM de Cl2Mg, 200 µ M de cada dNTP , 10 pM de cada uno de los primers y 1,25 U de Taq polimerasa (GIBCO). La reacción de amplificación se realizó usando un termociclador Progene Techne y consistió en 30 ciclos de desnaturalización (30 segundos), annealing (30 segundos) y extensión (45 segundos). En la tabla 1 se detalla la localización cromosómica, secuencia de los primers y la temperatura de annealing para cada STR. Un primer de cada pareja se marcó con el fluorocromo Cy5, indicado con un asterisco.

Locus Localización Primers Annealing
FIBRA/FGA 4q *5´-GCCCCATAGGTTTTGAACTCA-3´

5´-TGATTTGTCTGTAATTGCCAGC-3´

 60ºC
D21S11 21q *5´-ATATGTGAGTCAATTCCCCAAG-3´

5´-TGGAGAACATTAACTAATACA-3´

 60ºC
D12S391 12 *5´-TGGCTTTTAGACCTGGACTG-3´

5´-AACAGGATCAATGGATGCAT-3´

 61ºC
D19S394 19p *5´-GTGTTCCTAACTACCAGGC-3´

5´-AGACTACAGTGAGCTGTGG-3´

 56ºC
D9S153 9q *5´-TTATGGCAGCCCAAATGGACTA-3´

5´- GCAGAATGTTGCCCAAAACTCA-3´

 67ºC
D9S1867 9q *5´-GTGAACTGCATCAGCCG-3´

5´-ATCAGCCAGGGTTTTCAACA-3´

 61ºC
D1S1656 1q *5´-GTGTTGCTCAAGGGTCAACT-3´

5´-AGAAATAGAATCACTAGGGAACC-3´

 59ºC

Se mezclaron 1-4 µ l del producto de PCR con 4 µ l de tampón de carga (formamida desionizada + azul dextrano) y 1µ l de cada marcador interno de peso molecular. Esta mezcla se desnaturalizó a 95ºC durante 5 minutos y se procedió a la electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida mediante un secuenciador automático de ADN ALF Express (Amersham Pharmacia Biotech). Las condiciones de electroforesis fueron 1500 V, y 25 W a una temperatura constante de 55ºC durante 130 minutos. Los picos correspondientes a los alelos de cada sistema STR fueron interpretados mediante el programa AlleleLinks versión 1.00.

Se consideró como indicativo de inestabilidad en un microsatélite la presencia de uno o más alelos nuevos manifestada como una diferencia en el patrón electroforético entre el ADN normal y el tumoral.(24) Se clasificaron como RER+ aquellos casos con inestabilidad en al menos 2 STRs. La pérdida de heterocigosidad se definió siguiendo los criterios propuestos previamente.(25) El análisis se repitió en todos los casos que mostraban alguna alteración para excluir la posibilidad de artefactos inespecíficos de la PCR o contaminación durante el procesamiento del ADN.

Recogida de datos clínicos

Se realizó una revisión retrospectiva de las historias clínicas, de las que se recogieron los siguientes datos: edad, sexo, tamaño en centímetros medido en el punto más ancho de la zona de captación de contraste , localización y comportamiento radiológico del tumor (presencia o ausencia de edema y reacción ósea).

Análisis Estadístico

La relación entre variables se analizó aplicando la prueba U de Mann-Whitney o el test exacto de Fisher, según procediese y estableciendo el nivel de significación en p<0,05. Se utilizó para ello el paquete estadístico SPSS 6.0 para Windows.

 

RESULTADOS

Hemos analizado 7 loci microsatélites en 25 meningiomas y 10 neurinomas. En las tablas 2 y 3 se resumen las características clínicas, de neuroimagen (sólo se indica si hay actividad osteolítica, osteoblástica, edema extenso o meningiomas múltiples) y anatomopatológicas de cada caso, así como el número de microsatélites analizados y número de alteraciones encontradas.

Tabla 2. Meningiomas.

Caso Edad Sexo Histolog Localización Tamaño (cm) Neuroimagen alteraciones/

STRs analizados
1 56 M MNG CONV 5   1/7
2 74 M MNG PL ESF 4,2   0/7
3 72 M MNG AT CONV 5,1 EDEMA 0/7
4 52 M MNG CONV 2,8 EDEMA

OSTEOBLAST

 0/7
5 77 V MNG PARASAG 2 EDEMA 0/7
6 53 M MNG T CEREB 5 EDEMA 0/5
7 64 M MNG PL ESF 3 MG MULTIPLE 0/7
8 55 M FIB T CEREB 6,8   0/7
9 65 M SEC APC 2,5   0/5
10 54 V MNG CONV 5 EDEMA 1/7
11 48 M MNG CONV 6,5   0/7
12 69 V FIB CONV 5,3 EDEMA

OSTEOLIT

 1/7
13 38 M MNG S CAV 2,5   0/7
14 52 V MNG PARASAG 6   0/7
15 46 M MNG AT PARASAG 5,2   0/7
16 47 M MNG AT CONV 6 EDEMA

MG MULTIPLE

 0/7
17 54 V FIB RAQ 1   0/7
18 56 V MNG PARASAG 4,8   1/7
19 40 M MNG PETCL 4   0/7
20 62 M FIB AT PARASAG 3 EDEMA 1/7
21 71 M FIB PARASAG 5   1/7
22 42 M MNG PARASAG 3,4   0/7
23 68 M TRANS S CAV 5 EDEMA 1/7
24 79 M MNG CONV 5 OSTEOLIT 3/7
25 50 M TRANS CONV 6   1/7

Abreviaturas: M mujer, V varón, MNG meningoteliomatoso, FIB fibroblástico, TRANS transicional, AT atípico, CONV convexidad, PARASAG parasagital, PL ESF planum esfenoidal, T CEREB tienda del cerebelo, PETCL petroclival, S CAV seno cavernoso, RAQ intrarraquídeo, OSTEOLIT actividad osteolítica, OSTEOBLAST actividad osteoblástica, MG MULTIPLE meningiomas múltiples.

 

Tabla 3. Neurinomas.

Caso Edad Sexo Localización Tamaño (cm) Nº de alteraciones/Nº STRs analizados
1 45 V VIII 2,6 0/7
2 57 M VIII 8 0/7
3 65 V VIII 4 0/7
4 42 M VIII 3 0/6
5 52 M VIII 3 0/7
6 48 M VIII 3,2 0/7
7 64 V VIII 2,5 0/7
8 69 M L3 2 0/6
9 51 M VIII (bilateral) 4,7 0/7
10 72 V VIII 2,8 0/7

Los pacientes con meningiomas son 19 mujeres y 6 varones, con una edad media de 57,76 años (rango:38-79). El grupo de pacientes con neurinomas está constituido por 6 mujeres y 4 varones de 56,5 años (rango:42-72).

La informatividad (índice de heterocigosidad) de los marcadores fue la siguiente: D1S1656, 82.35%; D12S391, 84.8%; D21S11, 76.4%; D19S394, 94.1%; FIBRA/FGA, 87.5%; D9S153, 82.3%; D9S1867, 85.7%.

El número y tamaño de los alelos detectados en el ADN tumoral y en el ADN constitucional correspondiente fueron iguales para todos los loci analizados en 16/25 (64%) meningiomas y en 10/10 (100%) meningiomas. En 9/25 (36%) meningiomas se encontró alguna alteración de microsatélites, si bien sólo uno de ellos (4%) presenta inestabilidad en 2 STRs y puede ser clasificado como RER+. En las figuras 1 a 7 se muestra el patrón de alelos obtenido en los 7 loci estudiados en este caso. Se trata de un meningioma meningoteliomatoso típico, sin ningún signo histológico de agresividad, cuya única peculiaridad consiste en una tendencia a infiltrar las meninges y la calota craneal suprayacente con un comportamiento osteolítico evidenciable en la neuroimagen (figuras 8 y 9). La evolución clínica de esta paciente fue favorable, sin datos de recidiva tras un año de seguimiento.

Tres meningiomas (15% de los casos informativos) mostraron pérdida de heterocigosidad del locus D21S11. No se encontró correlación entre la presencia de PDH en D21S11 y los parámetros histológicos, clínicos o neurorradiológicos analizados. El patrón predominante en los meningiomas con PDH en D21S11 es meningoteliomatoso en dos pacientes (casos 18 y 21) y transicional en el otro (caso 25).

Se detectó PDH en D1S1656 en tres casos (16,6%): un meningioma meningoteliomatoso (caso 24), uno fibroblástico (caso 12) y uno transicional (caso 23. Figura 10), ninguno con signos histológicos de atipia. Dos de ellos (casos 12 y 23) presentaban un extenso edema en la neuroimagen y dos (casos 12 y 24) actividad osteolítica. Uno de estos meningiomas con PDH en D1 es el caso 24, que presenta además fenotipo RER+ (Figura 3). La PDH en este locus se asocia a la existencia de actividad osteolítica (p=0,001), mientras que no se encontró asociación entre deleciones en 1q y otras variables analizadas.

En un meningioma fibroblástico atípico (5%) se encontró PDH en FIBRA/FGA (caso 20). Radiológicamente tenía un importante edema, sin reacción ósea.

Las PDH en D9S1867 (4,8%) y en D19S394 (4,3%) corresponden a dos meningiomas meningoteliomatosos típicos, sin ningún hallazgo destacable en la neuroimagen.

 

ICONOGRAFIA

Figura - 1
Figura - 1

Caso 24. Análisis del microsatélite D9S153. S = sangre. T = tumor. Los números asociados a cada pico indican el tamaño de los alelos en pares de bases. Se observa el mismo patrón en sangre y tumor para este locus.

 

Figura - 2
Figura - 2

Caso 24. Análisis del locus D9S1867. Sangre y tumor son homocigotos para el alelo 203.

 

Figura - 3
Figura - 3

Caso 24. Se muestran el análisis del ADN constitucional y dos amplificaciones independientes del tumor para el locus D1S1656 en las que se observa la pérdida del alelo 148 en el tumor.

 

Figura - 4
Figura - 4

Caso 24. Locus D12S391. No hay inestabilidad ni pérdida de heterocigosidad.

 

Figura - 5
Figura - 5

Caso 24. Inestabilidad en el locus D19S394. En el tumor aparece un alelo nuevo de 231 pb

 

Figura - 6
Figura - 6

Caso 24. Locus D21S11. Hay desplazamiento de uno de los alelos en el tumor. Se muestra la consistencia de los resultados en dos amplificaciones distintas

 

Figura - 7
Figura - 7

Caso 24. Locus FIBRA/FGA sin alteraciones. La diferencia de altura en el segundo alelo no cumple criterios para etiquetarla de PDH y es atribuible a la amplificación preferencial del alelo más pequeño.

 

Figura - 8
Figura - 8

Caso 24. RM coronal en la que se observa cómo el tumor atraviesa las meninges, invadiendo la calota craneal suprayacente.

 

Figura - 9
Figura - 9

Caso 24. TAC con contraste en el que se pone de manifiesto la actividad osteolítica.

 

Figura - 10
Figura - 10

Locus D1S1656 del caso 23. Hay una clara pérdida del alelo de 152 pb en el tumor.

 

DISCUSION Y CONCLUSIONES

Meningiomas y neurinomas son dos de los tumores más frecuentes del sistema nervioso y tienen importantes semejanzas a nivel molecular, lo que nos llevó a considerarlos conjuntamente en el presente estudio.

Se ha postulado que la inestabilidad genética es un evento precoz en el desarrollo de los tumores humanos al conducir a un incremento en la tasa de mutación.

Los trabajos que analizan la IM en meningiomas y neurinomas son escasos y los resultados muy discordantes.(15,16) Mientras que Pykett y cols., en un análisis de 14 meningiomas y dos lineas celulares de meningioma encuentran que el 25% presentan un fenotipo RER+(15), Simon y cols. no encontraron ningún caso de IM en 44 meningiomas de diverso grado histológico.(16) Zhu y cols clasificaron como RER+ el 2,4% de 41 meningiomas y el 0% de 10 neurinomas estudiados.(14)

Esta disparidad de resultados se explica quizá en gran medida por los distintos criterios utilizados para definir el fenotipo RER+ y por diferencias en la metodología empleada. Otros factores a tener en cuenta al comparar los resultados entre distintos estudios son el número y tipo de STRs analizados, puesto que no todos los microsatélites tienen la misma tendencia a presentar inestabilidad.(26) El desarrollo de sistemas de análisis automatizados de alta resolución permitirá obtener mayor precisión en las anomalías detectadas y avanzar en la unificación de criterios para definir la inestabilidad de microsatélites.(27)

En el presente estudio, utilizando un secuenciador automático fluorescente, hemos encontrado que la IM es en general poco frecuente en estas neoplasias (4% de los meningiomas, 0% de los neurinomas). Este 4% de IM en meningiomas ocuparía una posición más próxima a los datos de Simon y cols.(16) que a los de Pykett y cols.(15) Los meningiomas constituyen un grupo heterogéneo de tumores, tanto desde una perspectiva histológica como clínica. A la vista de nuestros resultados, este tipo particular de inestabilidad genética no parece desempeñar en la tumorigénesis meníngea el destacado papel que le atribuyen Pykett y cols.(15), pero quizá sea reflejo de algún subgrupo con peculiaridades desde el punto de vista clínico. Zhu y cols. en su análisis de 41 meningiomas encuentran un sólo microsatélite inestable en un tumor que procede de un paciente al que previamente se había sometido a radioterapia del SNC por un astrocitoma.(14) Pykett y cols. no especifican las características clínicas, radiológicas ni anatomopatológicas de los 3 meningiomas con IM en su serie, pero los tres muestran inestabilidad en 2 o más loci de 4 STRs analizados, por lo que los clasifican como portadores del fenotipo RER+.(15) El hecho de que el único meningioma con IM en nuestra serie tenga actividad osteolítica no deja de ser un dato aislado que tendrá que ser contrastado en posteriores estudios. La intensa investigación que se está desarrollando actualmente en este campo permitirá en el futuro próximo contestar a algunas de las cuestiones no resueltas sobre el significado de este nuevo mecanismo de carcinogénesis en estos tumores cerebrales.

El análisis de marcadores microsatélites nos permitió asimismo identificar algunos casos con PDH en estos loci. Estudios previos de PDH han implicado de modo reiterativo el cromosoma 22, en particular deleciones de la región que contiene el gen supresor tumoral NF2, en el desarrollo de meningiomas (18,28) y neurinomas.(29) Deleciones en 1p, 14q y 10q se asociaron con la progresión de meningiomas hacia grados más altos de malignidad.(20,21) Con menor frecuencia se encuentran en meningiomas deleciones de los cromosomas 6, 18 y 19.(30)

Nosotros hemos observado pérdidas alélicas de D1S1656 en el 12% de los casos (16,6% de los informativos), lo cual sugiere que esta región pudiera tener importancia en el desarrollo de meningiomas. Nuestro estudio no confirma los hallazgos previos que implican regiones del cromosoma 1 en meningiomas con un fenotipo histológico más agresivo. Sin embargo, es de destacar que la deleción en 1q se asocia de manera significativa a la presencia de actividad osteolítica y que uno de estos tres casos presenta además fenotipo de IM.

Un meningioma atípico presentó PDH en 4q, si bien no es posible obtener conclusiones de este dato aislado. En un trabajo previo no se encontraron PDH en ninguno de los 41 meningiomas para el marcador analizado del cromosoma 4.(14)

El hallazgo de un caso con PDH en 9q (4,8%) se aproxima al 3% de PDH descrito por Zhu y cols para el marcador del cromosoma 9 analizado en su serie (14), aunque las cifras no son suficientes para considerar estas regiones candidatas a albergar genes importantes en la histogénesis de los meningiomas. El mismo valor reservado debe concederse al hecho de que un meningioma de los 23 informativos para D19S394(4,3%) mostró PDH en este locus del cromosoma 19.

No hemos encontrado evidencias de PDH en estos siete loci para ningún neurinoma. Nuestros datos van, pues, en contra de la implicación de estas regiones cromosómicas en el desarrollo de neurinomas, si bien será necesario ampliar el número de casos en futuros estudios.

En conclusión, el presenta estudio demuestra la utilidad del método automático basado en fluorescencia para el análisis de microsatélites en meningiomas y neurinomas. Regiones de los cromosomas 1 y 21 podrían desempeñar un papel en la oncogénesis de algunos subgrupos de meningiomas. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto un escaso papel de la inestabilidad de microsatélites en el desarrollo de estos tumores, por lo que deben de predominar en ellos otros mecanismos de inestabilidad genética.

 

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